抗原，是指能在體內引起免疫反應的物質；某一物質能否成為抗原，首先是由它本身的某些性質決定的。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，人ELISA試劑盒且制備周期長，批間差異較大。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。抗原在ELISA試劑盒中應用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。
在使用雙單抗一步法時，應注意抗原過剩時的“鉤狀效應”。而單抗僅針對抗體的單一表位，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術成熟，產量大，批間差異小，但結合位點的單一也正是其弱點之所在，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結合位點的缺乏，等閑造成假陰性結果。人ELISA試劑盒多為體外的蛋白、病菌等各類物質，椰油機體本身的，如自身免疫缺陷病癥會對自身產生免疫。
抗原的純度不高，特異性不強；合成抗原一般為多肽片段，缺乏天然抗原所具有的立體結構表位，親和力不高，可能導致相應表位的抗體漏檢：基因重組抗原具有安全、特異性強、親和力高、產量大等特點，是一種比較理想的抗原，人ELISA試劑盒但其純化比較挫折。熒光和化學發光測定的敏感度均高于比色測定，標準曲線的線性范圍亦較比色反應寬，測定效果優于常用的比色ELISA試劑盒，抗體在ELISA試劑盒中應用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。
